Provocarea
Grupul de cercetare al profesorului Jessica Houston de la Universitatea de Stat din New Mexico investighează modalitățile unice în care măsurătorile rezolvate în timp pot fi utilizate în citometria în flux. Un domeniu important de atenție pentru grup este cartografierea metabolică a celulelor canceroase – evaluarea vitalității acestora – în prezența chimioterapicelor, folosind măsurători fluorescente pe durata de viață. O altă aplicație cheie vizează semnalizarea celulară fundamentală și activitatea receptorului, folosind transferul energiei de rezonanță Förster (fluorescență) (FRET) și proteinele fluorescenței.
Houston observă că citometria în flux rezolvată în timp este net diferită de majoritatea aplicațiilor existente de citometrie în flux, care se bazează pe date de intensitate a fluorescenței în stare de echilibru pentru a efectua funcții de numărare și sortare. Și citometrele de flux disponibile comercial, optimizate pentru date la starea de echilibru, nu sunt potrivite pentru cercetarea ei. Deci, ca prim pas, grupul ei a trebuit să-și construiască propriul citometru de flux.
Există două modalități binecunoscute de a măsura durata de viață a fluorescenței: în domeniul timpului folosind un laser pulsat sau altă sursă de lumină, sau în domeniul frecvenței. Houston explică: „Avem nevoie de un citometru de flux de mare capacitate pentru a număra și/sau a sorta în mod nedistructiv populații uriașe de celule, de exemplu, pentru a studia celulele canceroase metastatice din sânge, de exemplu. Și măsurătorile în domeniul timpului folosind numărarea fotonilor nu ar suporta debitul necesar. Așa că am decis să lucrăm în domeniul frecvenței, unde metoda stabilită este să aplicăm o modulație la laserul de excitație și să corelăm schimbarea de fază observată în emisia de fluorescență modulată.”
Solutia
Grupul Houston și-a dorit capacitatea de a folosi o mulțime de fluorofori diferiți în munca lor, în plus față de a se uita la fluorescența endogenă de la metaboliți precum NADH și FAD. Deci aveau nevoie de lungimi de undă laser multiple pentru a excita eficient toate aceste ținte diferite. De asemenea, aveau nevoie de lasere cu o calitate bună a modului, adică M2 scăzut, precum și de ieșire de înaltă stabilitate, atât în ceea ce privește orientarea fasciculului, cât și zgomotul de putere.
După o evaluare atentă, au decis să folosească lasere OBIS de la Coherent. Houston notează: „În prezent avem mai multe lasere OBIS la lungimi de undă, inclusiv 375 nm, 405 nm, 488 nm și 633 nm. Aceste lasere inteligente sunt perfecte pentru munca noastră. Pe lângă ieșirea lor de înaltă calitate, ele acceptă modularea digitală directă rapidă de care avem nevoie de lucru, în plus, este atât de ușor să adăugați și să eliminați aceste lasere plug & play, care au toate formă și potrivire identice.” Ea notează că disponibilitatea de 10 și chiar 100 de miliwați este o altă caracteristică importantă OBIS. Acest lucru se datorează faptului că atât de multe dintre experimentele ei se bazează pe măsurători ale duratei de viață în domeniul frecvenței, în care modulația digitală scade în esență puterea laserului la celula de flux cu 50%
Rezultatul
Houston afirmă că citometrul ei de flux personalizat și colecția ei în creștere de lasere OBIS s-au dovedit a fi o combinație de succes și au furnizat deja o mulțime de date atât pentru studiile ei de profilare metabolică, cât și pentru munca FRET.
Pentru profilarea metabolică, ea citează exemplul NADH în care durata de viață măsurată a fluorescenței depinde de faptul dacă acest metabolit este în principal într-o stare legată sau nelegată în celula care este evaluată. Acest lucru se corelează cu modul în care celula generează ATP, molecula energetică care alimentează majoritatea activității celulare. Activitățile metabolice din celulele normale se bazează în principal pe fosforilarea oxidativă mitocondrială (OXPHOS) pentru a genera ATP. Dar în multe tipuri de celule canceroase, glicoliza joacă un rol mai mare în producția de ATP, iar capacitatea OXPHOS este redusă. Deci, grupul Houston poate folosi durata de viață NADH ca măsură cantitativă pentru modul în care celulele răspund la tratamente noi, de exemplu.
Grupul utilizează, de asemenea, sistemul de achiziție rapidă a datelor cantitative FRET. Ei analizează aceste date pentru a înțelege mai bine interacțiunile proteină-proteină, pentru studii conformaționale a proteinelor și pentru a sonda acțiunile enzimelor. Houston notează: „Putem analiza lucruri precum dacă un fluorofor donator este într-o stare stinsă sau nu. De asemenea, putem captura atât emisiile donatorilor, cât și emisiile receptorilor. Din nou, aceste date pot indica eficacitatea terapiei pentru cancer. În concluzie, laserele OBIS și citometrul nostru de mare capacitate oferă într-adevăr o mulțime de date.”
References:
- J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin, and J. P. Houston, “Toward the Development of an On-Chip Acoustic Focusing Fluorescence Lifetime Flow Cytometer,” Frontiers in Physics, 2021 9:253 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.647985
- A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino, and J. P. Houston, “A Review of New High-Throughput Methods Designed for Fluorescence Lifetime Sensing From Cells and Tissues,” Frontiers in Physics, 2021 9:163 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.648553
- K. Nichani, J. Li, M. Suzuki, and J. P. Houston, “Evaluation of caspase-3 activity during apoptosis with fluorescence lifetime-based cytometry measurements and phasor analyses,” Cytometry A, 2020 97(12):1265-1275; PMC7738394
- F. Alturkistany, K. Nichani, K. D. Houston, and J. P. Houston, “Fluorescence lifetime shifts of NAD(P)H during apoptosis measured by time-resolved flow cytometry,” Cytometry A 2019; 95(1):70-79 PMC6587805
